凍存管冷凍步驟:

　　1、用預(yù)熱的PBS溶液洗滌細(xì)胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細(xì)胞(薄薄的液層足夠，胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據(jù)細(xì)胞系確定)。

　　2、37℃孵育細(xì)胞3-5分鐘。

　　3、細(xì)胞從底部脫離之后，終止孵育，加入含有血清的培養(yǎng)基，用移液器輕輕地懸浮細(xì)胞。

　　4、離心細(xì)胞懸液(500xg,5分鐘)，用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。

　　細(xì)胞計(jì)數(shù)

　　1、離心細(xì)胞懸液(500xg,5分鐘)，去除上清液，用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。

　　2、以1:1體積比混合細(xì)胞和凍存液(60%培養(yǎng)基，20%胎牛血清，20%DMSO)，然后轉(zhuǎn)移到凍存管中。凍存的細(xì)胞密度為1-5×106個(gè)/毫升。

　　3、含有細(xì)胞的凍存管建議以?1K/min的速率降溫，可以將凍存管置于?70℃含有異丙醇的容器中。如果凍存管存儲(chǔ)其他樣品，可以直接放置在?20℃，?70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻，4mL和5mL的凍存管需要先置于在?20℃冰箱過夜，然后再轉(zhuǎn)移到?70℃或者液氮的氣相。

　　4、然后轉(zhuǎn)移凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮，請(qǐng)將凍存管置于液氮的氣相，切勿置于液相。

　　操作凍存管復(fù)蘇，全程使用安全防護(hù)設(shè)備，建議穿實(shí)驗(yàn)服、戴棉質(zhì)手套且在安全的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行操作。條件允許情況下，請(qǐng)佩戴護(hù)目鏡或防護(hù)面罩。由于夏季室內(nèi)溫度會(huì)高于冬季，請(qǐng)格外小心。凍存細(xì)胞儲(chǔ)存過程中，凍存管的冷凍溫度須均勻。不均勻的受凍將會(huì)導(dǎo)致冰塞的產(chǎn)生，冰塞會(huì)抑制兩側(cè)的液體溫度傳遞進(jìn)而產(chǎn)生危險(xiǎn)的高壓力并導(dǎo)致凍存管受損。